Facteurs influençant la fluorescence

Rôle de la concentration et effet de filtre interne (effet de peau) 

La relation entre la concentration et l’intensité de fluorescence correspond graphiquement à une courbe en cloche : la fluorescence passe par un maximum pour une concentration optimale ; ainsi à une même intensité de fluorescence correspondent deux concentrations.
Il faut maximum opérer sur des solutions de concentrations faibles car il y a auto-inhibition de la fluorescence aux fortes concentrations, du fait de l’augmentation du nombre de collisions entre les molécules, qui dissipent l’énergie reçue, ou bien du fait de la formation de polymères non fluorescents.
Aux très faibles concentrations, la courbe de fluorescence est incurvée : le domaine de concentration utile est donc relativement étroit : limité vers le haut et vers le bas.
L’épaisseur de la solution traversée par la radiation excitatrice doit être faible, car la concentration optimale diminue quand l’épaisseur augmente ; c’est l’effet de filtre interne, dû à l’absorption par la solution de la lumière d’excitation et de la lumière de fluorescence.

Dans les conditions idéales, l’intensité de la fluorescence (F) est égale au produit de l’intensité de la lumière absorbée (F0) et du rendement quantique (Rq) ; elle s’exprime sous forme dérivée de la loi de Beer-Lambert :

F = F0 (2,3 e l c ) Rq  
e le coefficient d’absorbance linéique molaire.
c la concentration de la solution en moles par litre.
l l’épaisseur optique de la loi de Beer-Lambert. 

Dans le cas de solutions diluées, la fluorescence est directement proportionnelle à la concentration.

Extinction de fluorescence

Encore appelée inhibition de fluorescence ou quenching , elle est due à une interaction de la molécule fluorescente avec le solvant ou avec un autre soluté. Le rendement de fluorescence et/ou la durée de fluorescence sont diminués. Du point de vue pratique ceci signifie que le composé est moins fluorescent lorsqu’il est en présence d’une substance inhibitrice. C’est un des inconvénients lors d’un dosage dans un milieu biologique préalablement non purifié.
Mais l’extinction n’est pas uniforme et l’on peut en tirer parti. Lorsque le fluorophore et l’inhibiteur ont une forte affinité l’un pour l’autre, mêmes des trâces d’inhibiteurs peuvent conduire à une forte diminution de fluorescence.