Caractéristiques optiques

La profondeur de champ d’un objectif peut être exprimée selon : D = l / (4nsin2(a/2)) avec a = sin-1 (NA/n)

La profondeur de champ représente la distance physique le long de l’axe optique à travers laquelle le spécimen biologique fluorescent observé se trouve focalisé.
Il s’agit du déplacement possible selon l’axe z d’un point de l’objet avant que l’image ne change (voir annexe). Pour un objectif x100, NA=1,25 et n=1,515, pour l = 530 nm, D = 0,4 µm.
Certains auteurs considèrent qu’il n’est pas utile d’échantillonner selon l’axe z avec un pas inférieur à la profondeur de champ. Mais d’autres affirment cependant qu’une infinité de plans selon z est nécessaire pour arriver à une reconstruction correcte de l’objet.

Avec les caractéristiques de l’objectif ci-dessus, à 530 nm, le pas d’échantillonnage théorique est de dz = 0,248 µm et dx= dy = 0,09 µm. En pratique, dz = 0,125 µm (ou 0,25 µm) et dx= dy = 0,06 µm pour l’utilisation de la caméra en binning 1. Ces valeurs respectent, pour cet objectif, les conditions énoncées dans le théorème de Shannon appliqué au microscope. En binning 2, dz = 0,25 µm et dx= dy = 0,12 µm, ce qui reste satisfaisant.