Microscopie conventionnelle à sectionnement optique et déconvolution 3D-iterative (CELLSCAN)

I – Présentation générale :

Pour toute demande de conseils relatifs à l’utilisation pratique du Cellscan, il est considéré que chaque utilisateur a parcouru les notices d’utilisation du Cellscan, CellView et EPR server, disponibles auprès du responsable.

Introduction :

Un microscope optique conventionnel associé à un dispositif de déplacement axial nanométrique et à de puissants algorithmes de restauration et de reconstruction d’images permet de visualiser des échantillons biologiques en trois dimensions. L’objet est illuminé en entier (lampe), à la différence de l’approche confocale (laser).

Cette technique a été développé il ya une dizaine d’années pour contourner les problèmes liés à l’utilisation de la microscopie confocale soit :

  • une vitesse de balayage du laser insuffisante pour suivre des cinétiques rapides (ex: Ca2+) 
  • une concentration du faisceau laser en un point de focalisation entrainant une photodégradation du marqueur sonde. 
  • un faible rendement quantique des capteurs : 0,1 à 0,35 pour un photomultiplicateur et 0,6 à 0,8 pour des caméras de type SIT ou CCD.

Principe :

Au laboratoire UMR CNRS 7365 et FR3209, cette technique utilise un microscope optique conventionnel  Olympus IX-70 inversé associé à un module d’acquisition et à un module de traitement.

Le système Cellscan est compatible avec tout type de microscopes (modèle et marque). Un système de déplacement piezoélectrique est intercalé entre l’objectif et la tourelle porte-objectifs.

  • Piézo-électrique: Physik Instrumente (PI), type P-721.1, plage : ± 50 µm; pas minimum : 0,25 µm (0,125 µm dans certains cas). Pas minimum avant asservissement : 100 nm.
  • Obturateur Unblitz Electronic, Vincent Associates (temps acquisition minium : 0,1 s).
  • Tourelle porte-filtres.
  • Micro-ordinateur Pentium DELL OPtiGX pro 200 MHz, 320 Mo RAM, Disque dur.
  • Disques externes, clés USB et Graveur CD.
  • Sytème d’exploitation Windows
  • Logiciel d’acquisition par coupes sériées Cellview.

Une série d’images 2D est acquise en déplaçant le plan focal à travers l’objet et chacune des images 2D contient des informations de son plan focal (partie « nette ») et de tous les autres plans (partie « floue »). 
La partie « nette » de l’image correspond aux informations relatives au plan focal, le « flou » dans l’image provient des informations de tous les autres plans. 
Ces informations peuvent être séparées par traitement d’image afin d’estimer la vraie structure 3D de l’objet étudié.


II – Étapes :

La procédure d’acquisition et de traitement suit 3 étapes :

Acquisition de coupes 2-D (module d’acquisition) :

Le découpage optique consiste à déplacer le plan focal à travers l’échantillon, grâce à un système de déplacement en z (piezo-électrique, figure 1) contrôlé par ordinateur. 
Des images sont acquises à chaque position le long de l’axe optique (figure 2).

Système de nanodéplacement piézo monté sur l'objectif
Figure 1 : Système de nanodéplacement piézo monté sur l’objectif
Figure 2 : Acquisition des coupes dériées 2D par sectionnement optique (déplacement du plan de mise au point dans l’axe optique).

Déflouage des coupes 2-D (module de traitement) :

En microscopie optique, chaque image contient des informations des plans inférieurs et supérieurs au plan de focalisation. Il a été déterminé qu’environ 1% à 2% de l’information provenait effectivement de ce plan. Afin de supprimer l’information hors plan de focalisation, il est nécessaire de bien connaître les propriétés optiques de formation d’images (Figure 4) en mesurant ou calculant la fonction de transfert optique (ou point spread function, PSF) du système complet (microscope/détecteur). Le volume de données est traité informatiquement par des algorithmes de déconvolution, fondés sur l’équation classique de formation optique des images en utilisant la fonction de transfert préalablement déterminée (voir restauration d’images).

Figure 4: Représentation des clichés de diffraction (disque d’Airy) dans l’axe z.

Restauration d’images :

Le traitement d’image concerne la manipulation et l’analyse d’image (restauration, reconstruction et réhaussement ; numérisation et compression ; description et reconnaissance de formes).  Le but de la restauration d’image est de retrouver la scène originelle à partir d’observations dégradées (Figure 5). Ces techniques sont orientées vers la modélisation des phénomènes de dégradation (défocalisation, bruit) et l’application de procédures inverses afin d’obtenir une approximation de la scène originale.  Les différentes approches de restauration dépendent de l’hypoyhèse particulière faite à propos du modèle de dégradation et de formation de l’image (modèle linéaire ou non linéaire avec un bruit additif ou dépendant du signal). Les origines mathématiques de la restauration d’image sont intimement liées au domaine des équations intégrales car le principe physique d’un modèle linéaire de formation d’image peut se décrire par une intégrale de convolution. Le problème qui est à la base de la restauration d’image est de construire une estimée de l’objet observé en utilisant l’image de la PSF.

g = h ⊗ f + n

g : image formée à travers le système , h : PSF, ⊗ : symbole de convolution , f : objet réel et n : sources de bruit.

Figure 5 : Restauration d’image par déconvolution 3D itérative.

Fonction de transfert optique

La fonction de transfert optique décrit comment une source ponctuelle est déformée lorsqu’elle est imagée par un système optique. La source ponctuelle est en général tranformée en une tâche diffuse qui est due à la limite de diffraction du système (voir annexe). Elle dépend de plusieurs paramètres (ouverture numérique de l’objectif, optiques, alignement de la source d’excitation, indice de réfraction du milieu intra-échantillon et du milieu à immersion, longueur d’onde d’émission…). 
La réponse en fréquence, ou fonction de transfert optique (OTF) est fréquemment utilisée pour caractériser un système optique. L’OTF 3D est la transformée de Fourrier en trois dimensions de la PSF.


Mesure de la fonction de transfert

La PSF est généralement mesurée à partir de billes fluorescentes dont le diamètre est inférieur à la limite de résolution du système. On fait l’acquisition d’un ensemble d’images 2D en déplaçant le plan focal jusqu’à ce que l’on ait traversé tout l’objet. La modélisation de la chaîne d’acquisition complète permettra de traiter ces images afin d’obtenir une estimée 3D de l’objet.


Conditions non-standard

Les principes énoncés ci-dessus sont valables dans des conditions d’utilisation dites standard. Les conditions deviennent non-standard dès que l’un des paramètres (épaisseur et indice de l’huile ou de la lamelle, position de l’objet) est modifié :

  • l’épaisseur des lamelles peut varier de 0,13 à 0,19 mm d’une série à l’autre. L’indice de réfraction des lamelles change selon le type de verre utilisé dans leur fabrication. 
  • L’indice de réfraction de l’huile utilisée (pour immersion) varie avec la température. 
  • Pour l’étude des spécimens biologiques, souvent épais (> 5 µm), comparés à la profondeur de champ du microscope (0,4 µm environ à 530 nm), l’indice de réfraction est varible (plus proche de l’eau n=1,33, que de l’huile à immersion n=1,516). 

Le chemin optique des rayons traversants un tel système est différent de celui emprunté par les rayons correspondant à un système standard. De plus, une onde provenant d’une source ponctuelle positionnée à une certaine profondeur dans le spécimen n’est plus sphérique et l’image 3D comportera alors des aberrations sphériques.

Précautions à prendre lors des mesures

Une source de lumière d’excitation stable est essentielle à la mesure de spécimens fluorescents. Pour une lampe à vapeur de mercure, le temps de préchauffage est d’une trentaine de minutes environ avant que les conditions optimales d’utilisation ne soient atteintes. Les variations à court terme sont dues aux papillotements de l’arc au niveau des électrodes qui peuvent  alors produire un « papillotement » de la lumière. Ce phénomène est amplifié lors du vieillissement de la lampe (après 200 heures d’utilisation).

L’homogénéité de l’éclairage du champ de mesure (en terme d’intensité et de longueur d’onde) est également à vérifier. Celle-ci dépend de l’alignement optique du système d’illumination, du degré de focalisation de la lentille de projection vers le plan image de sortie -pupille de sortie dans un microscope à épifluorescence). Le centrage de la lampe et l’ajustement de la lentille du collecteur sont réalisés en observant l’image projetée sur une feuille blanche placée dans le chemin de la lumière après la lentille de projection. 
Toute lumière extérieure parasite est à supprimer, et les manipulations s’effectue à l’obscurité ou en cherchant à minimiser certains éclairages (lumière des moniteurs, voyants de contrôle…). 
Une table anti-vibration est recommandée pour éviter les vibrations mécaniques.

Le spécimen doit de préférence être repéré sous une lumière de longueur d’onde plus grande pour limiter le fading. On peut aussi utiliser la lecture par contraste de phase (éclairage en lumière blanche au dessus de la préparation).

La mesure de l’intensité de fluorescence du standard de référence doit, en toute rigueur, être réalisée sous les mêmes conditions que le spécimen : 

  • taille du standard de référence 
  • spectre d’excitation et d’émission de fluorescence 
  • pas de fading pendant la mesure 
  • quantité de fluorophore connue avec précision

Erreurs de mesure

  • Le photobleaching qui caractérise la perte de fluorescence du spécimen pendant l’excitation. 
  • La température 
  • Les poussières fluorescentes sur l’optique du microscope 
  • Le quenching de concentration ou « effet de peau » 
  • Le transfert d’énergie 
  • Une répartition non-uniforme de la sonde dans le champ de mesure 
  • Le bruit de fond (courant d’obscurité de la caméra, bruit électronique dans le système de mesures, lumière parasite d’excitation, lumière parasite due à des fuites dans le système optique, autofluorescence de l’optique, autofluorescence du spécimen).

Déconvolution EPR

Sur le principe des acquisitions par « coupes optiques », le système CellScan met en œuvre une étape de déconvolution numérique à l’aide d’algorithmes. Cellscan fait appel à une technologie de pointe en matière de corrections d’image : l’E.P.R (« Exhaustive Photon Reassignement » ou restitution quantitative des photons issus d’un point source à leur plan d’origine. 
Elle consiste en une minimisation au sens des moindres carrés avec contraintes, qui conduit à une déconvolution 3D itérative. Cette méthode de restauration d’image est née de la collaboration du Pr.Fay (University of Massachusetts Medical Center) et d’un industriel CSPI-Scanalytics, IPLAB actuellement. Cet algorithme est un des premiers mis sur le marché et donne de bons résultats à condition de ne pas sortir de son domaine de validité. Il est très utilisé en restauration d’images de fluorescence. L’algorithme nécessite la connaissance préalable de la PSF du système, mesurée en plusieurs points du champ à l’aide de sources ponctuelles calibrées afin d’évaluer les déformations spécifiques (aberration) du système complet. Cette fonction décrit la façon dont le système optique déforme le signal d’un objet ponctuel qui a son origine au-dessus ou au-dessous du plan de netteté. Pour chaque image, les photons « défocalisés » sont évalués et ré-insérés à leur point d’origine. Dans la méthode de l’E.P.R, les propriétés de distorsion et de profondeur de champ du microscope sont analysées et réversées mathématiquement afin d’obtenir des images plus nettes et plus contrastées.

La qualité du déflouage (déconvolution des plans 2D à l’aide de l’algorithme EPR) dépend directement des paramètres : convergence (10-5 recommandé), itération (entre 20 et 100), lissage (15) et essentiellement de la qualité du fichier PSF.

PSF

La PSF (réponse impulsionnelle) caractérise la fonction de transfert du microscope pour des conditions expérimentales particulières, propres à chaque expérience (incrément entre chaque plan, O.N, milieu de montage, objectif, filtres, sondes fluorescentes, longueurs d’ondes…). On utilise des billes fluorescentes en latex dont la longueur d’onde d’émission est la même que celle des spécimens biologiques à étudier. La taille des billes doit être inférieure à la limite de résolution du microscope. 
Théoriquement, elles devraient être aussi petites que possible et posséder l’intensité la plus forte possible (quasi Dirac). Dans la littérature, on adopte communément le compromis suivant : le diamètre de la bille (D bille)doit être inférieur ou égal à la moitié du diamètre du premier disque d’Airy ou encore D bille = 0,61 (l/NA).

Une fois le diamètre de la bille déterminé en fonction de la longueur d’onde et de l’ouverture numérique (D bille £ 0,25 µm pour l=530 nm et NA=1,25), la préparation de billes (suffisamment diluée) est placée sur la lame (ou entre lame et lamelles, comme le spécimen). L’acquisition des données s’effectue selon la procédure détaillée en annexe. On fait l’acquisition de la PSF du bas vers le haut de la bille afin de minimiser l’influence du bleaching. La normalisation permet d’avoir la même quantité d’énergie lumineuse dans chacun des plans et de compenser un éventuel bleaching du signal et/ou le papillotement de la source d’excitation. 
Bien que certaines régles aient été établies de manière à obtenir des fichiers PSF de bonne qualité (cf.annexe), seule la pratique et l’expérience permettent d’estimer la validité de tels fichiers (en coupe XZ ou YZ).

Profondeur de champ et échantillonnage 3D

 : la profondeur de champ d’un objectif peut être exprimée selon :

D = l / (4nsin2(a/2)) avec a = sin-1 (NA/n)

La profondeur de champ représente la distance physique le long de l’axe optique à travers laquelle le spécimen biologique fluorescent observé se trouve focalisé. Il s’agit du déplacement possible selon l’axe z d’un point de l’objet avant que l’image ne change (voir annexe). Pour un objectif x100, NA=1,25 et n=1,515, pour l = 530 nm, D = 0,4 µm.

Sur et sous-échantillonnage

Certains auteurs considérent qu’il n’est pas utile d’échantillonner selon l’axe z avec un pas inférieur à la profondeur de champ. Mais d’autres affirment cependant qu’une infinité de plans selon z est nécessaire pour arriver à une reconstruction correcte de l’objet. 
Avec les caractéristiques de l’objectif ci-dessus, à 530 nm, le pas d’échantillonnage théorique est de dz = 0,248 µm et dx= dy = 0,09 µm. En pratique, dz = 0,125 µm (ou 0,25 µm) et dx= dy = 0,06 µm pour l’utilisation de la caméra en binning 1. Ces valeurs respectent, pour cet objectif, les conditions énoncées dans le théorème de Shannon appliqué au microscope. En binning 2, dz = 0,25 µm et dx= dy = 0,12 µm, ce qui reste satisfaisant. 

Capteur :

Plusieurs détecteurs CCD Kodak sont disponibles, présentant des capacités de refroissement (-20 °C pour la Caméra KUV1400 de  Princeton Inc ;  +10°C pour la caméra Sensys de Photométrics) et de performances différentes.

1) Sensys, Photometrics : caméra disponible par défaut sur le système Cellscan

2) Kodak KAF-1400UV : caméra de rechange 
Format : 1317 (H) x 1035 (V) ; 8,98 x 7,04 mm ; 6,8×6,8 µm pixels. 
Capacité : 45000 électrons/puits. 
Spectre : 190-1080 nm 
Grade 0. 
Température : -40°C (air), 
Temps de lecture : 1,4 s à 1MHz. 
Contrôleur : ST138

Caméra CCD refroidie (Princeton Instruments), très sensible (10-7 lux) pour la détection de signaux de fluorescence faible. Il est donc nécessaire d’accumuler (intégrer) le signal pendant des temps relativement long, ce qui engendre une élévation de température au niveau du capteur. Il est donc nécessaire de refroidir le capteur CCD (par circulation d’air, 3 étages Peltier), ce qui améliore considérablement le rapport signal/bruit.