Microscopie 3D spectrale et confocale à balayage laser en mode monophotonique (Confocal Laser)

La Microscopie Confocale (Monofocale) à Balayage Laser Conventionnelle (monophotonique) représente une avancée technologique majeure dans l’imagerie biologique. Parmi les méthodes de Microscopie à sectionnement optique qui permettent l’observation d’une cellule entière par coupes optiques successives horizontales selon l’axe optique vertical la Microscopie Confocale à Balayage Laser (CLSM pour Confocal Laser Scanning Microscope) reste la technique de référence pour visualiser des échantillons biologiques en trois dimensions fournissant des images de haute résolution, en éliminant la lumière parasite.

La géométrie de l’optique confocale prouve son avantage indéniable sur la microscopie de fluorescence conventionnelle en discriminant les plans en dehors du plan focal. Le diamètre de la zone illuminé étant très petite, la constitution  de l’image totale de l’objet nécessite de balayer le faisceau laser point par point sur l’objet à l’aide d’un système constitué par deux miroirs vibrants en x et en y (miroirs galvanométriques). Le déplacement selon l’axe axial (en z) est réalisé grâce à une sur-platine (quartz piézo-electrique), faisant varier le plan de mise au point, ce qui permet d’obtenir une série de coupes optiques appelées séries Z.

Un empilement par projection de sections optiques conduit facilement à une image reconstruite en 3D montrant une distribution de sondes fluorescentes, dont la résolution spatiale limitée par la résolution. La résolution maximale théorique pour un microscope optique, définie par E . Abbe, est  d = 0.61 l / NA avec NA l’ouverture numérique de la lentille de l’objectif et la longueur d’onde utilisée. Lorsque la lumière utilisée est cohérente (laser), la résolution d’un microscope confocal peut en théorie atteindre  la valeur de 0.46 l / NA soit 0.19 µm à 580 nm pour un objectif NA/1.4. La moins bonne résolution axiale (en Z) d’environ 0.4 µm est dûe à la diffraction d la lumière, qui entraîne une déformation de l’image d’un point infiniment petit sous forme d’un ellipsoïde d’un diamètre maximal de 0.15 µm dans le plan XY, et de 0.4 µm dans le plan XZ (l’axe Z étant parallèle à l’axe optique). Un autre paramètre important consiste à définir la profondeur de champ qui fixe la taille de l’incrément en z. La profondeur de champ, qui représente la distance le long de laquelle un point de l’échantillon reste net lorsque la focalisation est modifiée, est principalement fonction de  l et de NA. 
Il est donc inutile de choisir un incrément plus petit si l’information n’a pas été modifiée et augmenter la quantité de données à stocker. 
L’incrément z est donc fixé au dessus de la profondeur de champ (généralement de 0.25 à 1 µm). Pour augmenter la résolution axiale, des algorithmes de restauration d’images peuvent être mis en oeuvre au laboratoire avec un algorithme 3D itératif (voir système Déconvolution ).


Principe du balayage laser d’un microscope confocal

Pour constituer l’image, un balayage point par point à l’aide d’une irradiation de type Laser est assuré par deux galvanomètres dans les deux directions (X et Y) dont la fréquence de balayage doit permettre d’acquérir le signal de fluorescence le plus rapidement possible. Un déplacement selon l’axe optique (Z) permet l’acquisition de coupes sériées.

Principe du balayage laser d’un microscope confocal


Principe de la confocalité d’un microscope à balayage laser

Selon les systèmes, l’illumination du spécimen par la lumière laser, ainsi que la détection du signal sont réduits à un point, grâce à l’utilisation d’un ou de deux diaphragmes de faible diamètre (« pinholes ») situés dans les plans confocaux c’est-à-dire conjugués au plan de mise au point dans l’objet. Ainsi, la lumière émise hors du plan de mise au point n’atteint pas le détecteur. 
Le diaphragme d’émission a pour but d’exclure physiquement le signal lumineux provenant des plans adjacents au plan focal. 
 Seule la lumière d’émission de fluorescence provenant du plan focal est collectée au niveau du détecteur (photomultiplicateur) pour constituer l’image. 
L’ouverture (taille du disque d’Airy) du diaphragme (pin-hole) va conditionner en grande partie la qualité optique de l’image.

Principe de la confocalité d’un microscope à balayage laser


Inconvénients de la microscopie confocale à balayage laser classique

Cependant, l’utilisation de la microscopie confocale monophotonique pose le problème de l’observation de cellules vivantes. En effet, la puissance de la source laser de l’ordre de 1,5 mW au plan focal et entraîne une photodégradation rapide de la sonde fluorescente (photobleaching). A cette limitation très importante au niveau de la quantification relative de l’intensité du signal de fluorescence s’ajoute le photodommage cellulaire irréversible liée à la densité énergétique importante concentrée au point de focalisation. Ce phénomène, bien connu, qui modifie et altère le métabolisme cellulaire a été décrit dans de nombreux travaux. C’est une des raisons pour laquelle les spécimens fixés et montées entre lames et lamelles représentent la grande majorité des échantillons analysés en microscopie confocale. 
Les applications développées dans ce projet nécessitent des profondeurs d’analyses supérieures à 100 µm au sein des cultures tridimensionnelles (co-culture cellule musculaire lisse-cellule endothéliale pour un bio-vaisseau, chondrocyte dans le cartilage articulaire, etc.). Le microscope confocal ne peut répondre à cette attente puisque les applications restent limitées à des échantillons de faible épaisseur (< 60 µm) En effet, la profondeur de pénétration liée à une illumination laser en mode continu reste très insuffisante pour espérer analyser des phénomènes biologiques au niveau d’échantillons épais (culture 3D en alginate, co-culture cellulaire, cartilage). Au delà des limitations concernant la collection des signaux de fluorescence limités par la profondeur d’analyse, le microscope confocal conventionnel ne permet pas d’exploiter les différentes résolutions de la fluorescence. En effet l’utilisation des traceurs fluorescents nécessite une parfaite connaissance tant du point de vie qualitatif que quantitatif. Pour y répondre, de nouvelles approches méthodologiques ont été développées au sein de la FR3209 et reposent sur l’utilisation des différents modes de résolution de la fluorescence (analyses spectrale et temporelle). Il s’agit de technique FRET (transfert d’énergie), de FRAP (photoblanchiment), de FISH (génétique), de FLIM (durées de vie) sur la base des spectres d’émission et de durées de vie de fluorescence. 


Leica 2

Microscope Confocal Leica SP2_AOBS-MP