Microscopie 3D de fluorescence résolue dans le temps (FLIM)

La  durée de vie de fluorescence par microscopie résulte de l’association de la spectroscopie de fluorescence (détermination des durées de vie) et de la microscopie à fluorescence appliquée à l’imagerie cellulaire (Lakowicz 1996). La microscopie de fluorescence présente l’avantage de s’affranchir de nombreuses contraintes liées à la fluorimétrie classique  (concentration de la sonde, densité cellulaire faible, étude et visualisation à l’échelle cellulaire). De plus, il s’agit du seul moyen d’investigation actuel ayant une résolution suffisante pour préciser la distribution de la sonde  fluorescente puisque qu’il recueille les signaux de fluorescence émis au niveau du lieu d’incorporation des sondes.

L’intensité du signal de fluorescence reflète la concentration de la sonde si le rendement quantique (QE) reste constant (c’est-à-dire insensible à son environnement), ce qui nécessitera la mise en œuvre d’étapes de calibration. Comme la durée de vie t est reliée à QE, la mesure de t , dont la valeur est insensible au photobleaching, permet de valider la procédure de calibration. Pour les mesures de durées de vie des états excités des fluorophores, dans une certaine mesure, toutes les imperfections optiques du système (lentilles, prismes, miroirs du microscope, …) ainsi que la photodégradation du traceur n’ont pas d’influence. 
De plus, la détermination des durées de vie est possible, malgré la présence de molécules fluorescentes dans les échantillons  biologiques à doser, c’est-à-dire avec un bruit de fond non spécifique important. 
Si l’observation de la fluorescence en excitation continue est une technique classique, par contre la résolution temporelle de l’émission de fluorescence (excitation pulsée ou modulée) sous microscopie n’est généralement observée que grâce à des équipements réalisés dans des laboratoires de recherche.

Le PTIBC IBISA Nancy dispose des trois méthodes de détermination des valeurs de durées de vie des états excités précurseurs de la fluorescence:

* en spectroscopie (cuves) : SLM48000 et Boxcar

* en microscopie (lamelles): TSCPC-FLIM Becker&Hickl 

* en microscopies et macroscopies : TCSPC- PICOQUANT

Notice B&H FLIM SPC-730

Principe du Comptage Monophotonique corrélé au temps

Modules disponibles

Becker, W., Benndorf, K., Bergmann, A., Biskup, C., König, K., Tirplapur, U., and Zimmer, T. (2001). FRET measurements by TCSPC Laser Scanning Microscopy. Paper presented at : European Conferences on Biomedical Optics (Munich). 

Gautier, I., Tramier  M., Durieux, C., Coppey, J., Pansu, R., Nicolas, J.C., Kemnitz, K. and Coppey-Moisan, M. (2001). Homo-FRET microscopy in living cells to measure monomer-dimer transitions of GFT tagged proB. 

Riquelme, D. Dumas, J. Valverde, R. Rasia, J.F. Stoltz, Analysis of the 3D structure of agglutinated erythrocyte using
CellScan and confocal microscopy. Characterisation by FLIM-FRET. SPIE 5139 (2003), 190-198teins. Biophys J 80, 3000-8. Notice FLIM BIORAD