Microscopie 3D à balayage laser multiphotonique (Multiphoton SHG)

Les limitations précédentes  liées à une excitation de type monophotonique (lampe ou laser continu) sont affranchies à l’aide d’une illumination de type Multiphotonique. 
Le PTIBC-IBISA Nancy est équipé depuis 2002 d’une chaîne laser qui combine un laser de pompe solide à un oscillateur d’impulsions. Ce dernier assure la génération d’impulsions brèves (femtoseconde) pulsée à haute fréquence (de l’ordre de 80 MHz) avec génération du phénomène de double-photon (multiphoton) au niveau du plan focal. Par la nature des rayonnements utilisés (proche Infra-rouge et non plus UV-Visible), la profondeur de pénétration de la lumière est plus importante qu’en mode monophotonique étant donné qu’elle se situe au niveau de la « fenêtre spectrale optique» des tissus (moindre absorption et diffusion de la lumière). 

-Cette technique donne accès à des analyses au niveau des régions profondes et reste compatible avec l’observation du vivant (sans photodommage). De plus, les rayonnements utilisés (Rouge –IR) sont plus pénétrants dans les objets épais (analyse jusqu’à 300-400 µm en double-photon 700-1100 nm).

- Au niveau matériel, ce confinement est possible par l’utilisation d’un laser pulsé IR. L’énergie est concentrée dans des pulses lasers très brefs, typiquement 200 femtosecondes pour une fréquence de 100 MHz. L’excitation MP est un phénomène non linéaire, et la focalisation permet de concentrer l’excitation au niveau du plan focal. 

- Le photobleaching en dehors de ce plan est réduit.

- Le volume focal est de l’ordre de qqs fl.

Comparaison d’une excitation Monophotonique et Multiphotonique. Dans le premier cas (1P, 488nm) , on observe un cône de fluorescence. Dans le second (2P, 976nm), uniquement un spot d’excitation.

Capture d’écran 2013-05-15 à 16.01.59

Principe de l’illumination laser en mode Multiphoton

Principe de l’illumination laser en mode Multiphoton

Lorsqu’une excitation en mode pulsée (de l’ordre de la femto-seconde, avec génération du phénomène de double-photon au niveau du plan de focalisation) est utilisée, les performances sont très nettement améliorées avec notamment : 

  • A la différence du mode monophotonique une photodégradation de la sonde strictement limitée au plan de focalisation (restauration d’images inutile) 
  • une compatibilité pour l’observation dans le temps sur le vivant (physiologie). 
  • une détermination aisée des temps de vie de fluorescence (durée de vie). 
  • une profondeur d’analyse augmentée en termes d’épaisseur d’échantillons (intérêt pour l’analyse des tissus épais et diffusants).

multiphoton2

Certains  effets phototoxiques  ont été décrits. 
Les images acquises à l’aide de la Microscopie MultiPhoton sur des échantillons épais sont parfaitement nettes au plan de focalisation en comparaison à celles obtenues par Microscopie Confocale Monophotonique. 

Ce mode d’excitation présente des intérêts multiples qui sont illustrés par quelques expériences réalisées au PTIBC IBISANancy :