Microscopies

Pour la plupart des phénomènes biologiques étudiés au sein des équipes de la FR3209 , le niveau d’investigation se situe à différents niveaux; du tissu à la la cellule voire à l’échelle moléculaire (dosages intracellulaire, interaction intermoléculaire…). Les méthodologies mises en œuvre dans le cadre de ces études reposent essentiellement sur l’analyse du signal de fluorescence soit par cytométrie en flux pour des cellules isolées (cellules circulantes du sang) soit par microscopie de fluorescence pour les cellules adhérentes (endothéliales, musculaires lisses, chondrocytes, cellules tumorales, etc…) ou plus récemment par macroscopie pour les objets de grande dimension.

La Fluorescence présente l’avantage de s’affranchir de nombreuses contraintes afférentes à la fluorimétrie classique (concentration de la sonde fluorescente, densité cellulaire faible, étude et visualisation à l’échelle cellulaire). De plus, il s’agit du seul moyen d’investigation actuel ayant une résolution suffisante pour préciser la distribution de la sonde fluorescente puisque qu’il recueille les signaux de fluorescence émis au niveau des sondes incorporées.  La compréhension des phénomènes d’interactions cellulaire (adhésion par exemple) nécessite le plus souvent l’acquisition et le traitement des informations sub-cellulaires comme une reconstruction volumique (en 3 Dimensions).

Cette approche est permise par le biais des méthodes de Microscopie à sectionnement optique (coupes optiques successives horizontales selon l’axe optique vertical) et la reconstruction d’un objet biologique entier ou rendu en volume (cellules, vaisseau, etc…).

Microscopie de Fluorescence Conventionnelle

Le principe du microscope à fluorescence (microscope conventionnel en champ lointain) est d’illuminer l’échantillon fluorescent à une longueur d’onde absorbée par  le fluorochrome et de ne recueillir que la lumière correspondant à la fluorescence réémise, grâce à l’utilisation de filtres et de miroirs spécifiques.

Filtres

L’illumination de l’objet fluorescent dans son entier provient généralement d’une lampe à vapeur de mercure produisant la plupart des longueurs d’onde visibles.

Lampe à vapeur de mercure

Cependant, les molécules de fluorochrome présentes en dehors du plan de mise au point sont également excitées et émettent de la lumière qui vient troubler l’image, diminuant ainsi le contraste et la résolution spatiale.

Pour s’affranchir des problèmes d’interférence liés à  cette lumière parasite associée au phénomène de diffraction (figure ci-dessous), trois stratégies d’approches technologiques ont été développées :

(a)  microscopie conventionnelle : suivie d’une étape de traitement d’images par déconvolution (microscopie à sectionnement optique / déconvolution).

(b) microscopie et macroscopie confocale à balayage laser :  sur la base d’une configuration optique confocale particulière (acquisition des images 2D) 

(c) microscopie et macroscopie à illumination multiphotonique:  On distingue selon le type d’illumation laser (continu ou pulsé) les modes monophotonique et multiphotonique.

Microscopie strategie