Notions Diverses

Formation optique d’une image

–> 2 images interpénètrent dans le microscope

1) l’objectif projette une image amplifiée de d ’objet éclairé en un endroit précis du tube. Cette image n ’est pas intercepté par un écran mais est formée par une image du tube intermédiaire.

2) cette image est observée avec un oculaire (éventuellement grossie) qui permet la projection sur la rétine de l ’œil.

Trajet des rayons d’éclairage (a):

Tout  près et derrière la source de lumière S se trouve le collecteur, qui le plus souvent fait corps avec la source de lumière. Le collecteur reproduit la source de lumière S dans le plan focal avant S’ du condenseur. Dans ce plan se trouve également le diaphragme d’ouverture. La source de lumière est reproduite ensuite par le condenseur et l’objectif dans le plan focal arrière S’’ de l’oculaire. La pupille de l’œil de l’observateur se trouve à cet endroit. Les plans S, S ‘, S’’ et S’’’ sont dits optiquement conjugués, parce que chacun est une image optique du précédent. 

Trajet des rayons de formation des images (b): 

Le diaphragme d’ouverture O limite l’ouverture du collecteur. Ce diaphragme est reproduit par le condenseur dans la préparation en O’. L’objectif projette dans le plan de l’image intermédiaire une image agrandie de la préparation et du diaphragme de champ L’’, qui est observée encore agrandie à travers l’oculaire. La troisième image L’’’ du diaphragme de champ et de la préparation se produit sur la rétine de l’œil. Nous avons ainsi deux groupes de plans optiquement conjugués, donc des trajets de rayon entremêlés.

Mais les diaphragmes S’ et L remplissent d’autres fonctions. Le diaphragme d’ouverture permet de diaphragmer l’image de la source de lumière. Il dirige ainsi, dans le plan focal arrière de l’objectif, le faisceau de rayons de diamètre convenable. Le réglage du diaphragme d’ouverture permet d’élargir ou de resserrer les cônes de rayons partant des différents points de l’objet. Le diaphragme de champ modifie la section du faisceau dans le plan de l’objet. Il doit être ouvert juste assez pour éclairer le champ-objet, et pas plus.

Fluophores

Un bon fluorophore doit posséder :

  • une absorbance linéique molaire élevée
  • un rendement quantique de fluorescence le plus près possible de 1
  • un spectre d’émission dans le visible
  • un déplacement de Stokes supérieur à 50 nm
  • une faible vitesse de décomposition
  • éventuellement une stabilité des propriétés de fluorescence une fois couplé à une molécule non fluorescente (proétine) que l’on cherche à coupler.

Peu de substances rassemblent ces propriétés. La fluorescéine, la rhodamine, les coumarines, l’umbelliférone et leurs dérivés sont les plus utilisés. La durée de vie de toutes ces substances sont brèves, de l’ordre de quelques ns.

Phénomène de fluorescence – diagramme de Jablonsky

Par définition, une molécule à l’état fondamental est dite stable. Dans la très grande majorité des cas, les molécules susceptibles de fluorescer dans le visible possèdent un système d’électrons appariés dans cet état.Selon le principe de Pauli, au maximum 2 électrons peuvent parcourir la même orbitale dans l’état fondamental et sont alors de spins opposés (mode de rotation de l’électron sur lui-même). Par conséquent le spin global de la molécule est nul, et l’état fondamental est un état “ singulet ” de repos. Les électrons de la couche périphérique se trouvent sur l’orbitale disponible de plus faible énergie, ou orbitale “ liante ”. Les échanges d’énergie avec un rayonnement électromagnétique se font par saut d’énergie, les électrons passent donc d’une orbitale quantique à l’autre. Après absorption d’un photon de longueur d’onde suffisamment énergétique (dans la bande d’adsorption des molécules), il se produit un apport d’énergie E = hc/l (où h : constante de Planck et c : célèrité de la lumière) que les électrons absorbent. Ils accèdent alors à un niveau d’énergie plus élevé et la molécule se trouve dans un état énergétique supérieur : elle est dite “ excitée ”. Les niveaux d’énergie atteints étant par nature instables, la durée de vie d’un électron sur un tel niveau est de l’ordre de quelques nanosecondes. La molécule “ excitée ” devient alors le siège d’une série de réactions dont les manifestations sont diverses, jusqu’à son retour à l’état stable.Les photons qui ont des longueurs d’onde situées dans l’ultraviolet (< 400 nm) et le visible (> 400 nm) ont une énergie suffisante pour générer une excitation électronique spécifique des molécules.Deux types de processus photophysiques permettent à la molécule excitée de dissiper son énergie excédentaire  :

les processus de désactivation non radiative et les processus de désactivation radiative ou luminescence.

Selon le spin, on distingue 2 états excités caractérisés d’énergie et de nature différente : l’état singulet instable (S) et l’état Triplet métastable (T). Si l’émission radiative se produit entre deux états de même multiplicité (singulet excité – singulet fondamental), le phénomène est appelé FLUORESCENCE. Si l’émission se produit entre deux états de multiplicité différente (Triplet – singulet fondamental), le phénomène est appelé PHOSPHORESCENCE.Le diagramme de Jablonsky schématise l’ensemble du processus d’excitation et de désactivation.Les photons émis par fluorescence ont une énergie plus faible que celle des photons absorbés (loi de Stockes). D’après la loi précédente (l = hc/E), le spectre d’émission de fluorescence est décalé vers des longueurs d’onde plus grandes que la longueur d’onde d’excitation.

Diagramme de Jablonsky

Fluorescence résolue dans le temps

L’intensité de fluorescence est une fonction de la concentration de la substance qui émet et des facteurs macroscopiques du milieu d’origine physique (température, viscosité…) ou chimique (inhibiteurs, etc.). Pour bien maîtriser ces systèmes d’analyse, il peut être avantageux de faire intervenir la mesure de la durée de vie t des états excités précurseurs de la fluorescence (déclin exponentiel de la forme exp(-t/t).

La mesure de t peut-être obtenue par des techniques induites de moins en moins utilisées, mais surtout par deux principes directs qui sont :

  • l’excitation pulsée à l’aide de lampes à éclairs, de lasers pulsés, etc. On peut analyser une évolution temporelle du déclin à l’aide de plusieurs pulseurs techniques : comptage de photons, box-car permettant une mesure dans une fenêtre temporelle, caméra à fente (courtes durées de vie), oscillographe, etc..
  • l’excitation modulée à l’aide de sources continues ou pulsées. La valeur de t peut être atteinte par la mesure du déphasage entre excitation et fluorescence; elle peut également être mesurée par la démodulation du signal. 

Ces techniques spécialisées sont maintenant tout à fait opérationnelles et permettent classiquement de mesurer des durées de vie comprises entre quelques ps et quelques centaines de ns correspondant aux valeurs expérimentales.

Selon les techniques, il est possible d’étudier des déclins non exponentiels et des variations temporelles d’anisotropie de fluorescence.

Facteurs influençant la fluorescence

Rôle de la concentration et effet de filtre interne (effet de peau) 

La relation entre la concentration et l’intensité de fluorescence correspond graphiquement à une courbe en cloche : la fluorescence passe par un maximum pour une concentration optimale ; ainsi à une même intensité de fluorescence correspondent deux concentrations.
Il faut maximum opérer sur des solutions de concentrations faibles car il y a auto-inhibition de la fluorescence aux fortes concentrations, du fait de l’augmentation du nombre de collisions entre les molécules, qui dissipent l’énergie reçue, ou bien du fait de la formation de polymères non fluorescents.
Aux très faibles concentrations, la courbe de fluorescence est incurvée : le domaine de concentration utile est donc relativement étroit : limité vers le haut et vers le bas.
L’épaisseur de la solution traversée par la radiation excitatrice doit être faible, car la concentration optimale diminue quand l’épaisseur augmente ; c’est l’effet de filtre interne, dû à l’absorption par la solution de la lumière d’excitation et de la lumière de fluorescence.

Dans les conditions idéales, l’intensité de la fluorescence (F) est égale au produit de l’intensité de la lumière absorbée (F0) et du rendement quantique (Rq) ; elle s’exprime sous forme dérivée de la loi de Beer-Lambert :

F = F0 (2,3 e l c ) Rq  
e le coefficient d’absorbance linéique molaire.
c la concentration de la solution en moles par litre.
l l’épaisseur optique de la loi de Beer-Lambert. 

Dans le cas de solutions diluées, la fluorescence est directement proportionnelle à la concentration.

Extinction de fluorescence

Encore appelée inhibition de fluorescence ou quenching , elle est due à une interaction de la molécule fluorescente avec le solvant ou avec un autre soluté. Le rendement de fluorescence et/ou la durée de fluorescence sont diminués. Du point de vue pratique ceci signifie que le composé est moins fluorescent lorsqu’il est en présence d’une substance inhibitrice. C’est un des inconvénients lors d’un dosage dans un milieu biologique préalablement non purifié.
Mais l’extinction n’est pas uniforme et l’on peut en tirer parti. Lorsque le fluorophore et l’inhibiteur ont une forte affinité l’un pour l’autre, mêmes des trâces d’inhibiteurs peuvent conduire à une forte diminution de fluorescence.

Endothélium

Vaisseaux :

Il est constitué d’une monocouche de cellules endothéliales qui tapissent  l ’intérieur du système cardio-vasculaire (interface avec le sang). 

C ’est l’acteur essentiel de la physiologie et de la pathologie du vaisseau sanguin :

  • prothrombotique sous stimulation (infection, inflammation), capable d ’exprimer des récepteurs pour les plaquettes et leucocytes.
  • couche anticoagulante (facteurs antithrombotiques) / coagulation
  • régule le diamètre des vaisseaux (vasodilatateurs ou constricteurs)
  • barrière semi-perméable pour le transport entre le sang et les tissus (membrane basale)

Diffraction de la lumière

Rappel théorique de la diffraction au sens de Fresnel-Kirchoff

La diffraction est un phénomène d ’éparpillement de la lumière que l ’on observe lorsqu’une onde est matériellement limitée. Elle joue dans la formation  des images un rôle décisif puisque tout système optique limite irrémédiablement l’étendue de l ’onde incidente. L ’interprétation de ce phénomène s ’appuie sur la propagation ondulatoire de la lumière et est connue sous le principe d ’Huygens-Fresnel.

Diffraction de la lumière

L ’énoncé du principe d ’Huygens-Fresnel comporte deux parties :

  • La lumière se propage de proche en proche. Chaque élément de surface atteint par elle se comporte comme une source secondaire qui émet des ondelettes sphériques dont l ’amplitude est proportionnelle à cet élément (contribution d ’Huygens).
  • L ’amplitude complexe de la vibration lumineuse en un point est la somme des amplitudes complexes des vibrations produites par les sources secondaires. On dit que toutes les vibrations interférent pour former la vibration au point considéré (contribution de Fresnel).

Diffraction à l ’infini par une ouverture circulaire

La  figure de diffraction ci dessous  montre, en fonction du temps de pose, une tâche centrale brillante entourée d ’anneaux alternativement noirs et brillants.

Diffraction à l ’infini par une ouverture circulaire

Le premier anneau noir a pour rayon angulaire :

e = 1,22 l / 2R où R est le rayon de l ’ouverture circulaire.

On constate une équidistance angulaire des anneaux noirs voisine de l / 2R. 
La tâche centrale a une importance relative ancore plus grande et l ’intensité relative du premier maximum  secondaire par rapport au maximum principal est 0,0175.

Diffraction suite

Cette tâche est appelée Tâche D’AIRY.

Caractéristiques optiques

La profondeur de champ d’un objectif peut être exprimée selon : D = l / (4nsin2(a/2)) avec a = sin-1 (NA/n)

La profondeur de champ représente la distance physique le long de l’axe optique à travers laquelle le spécimen biologique fluorescent observé se trouve focalisé.
Il s’agit du déplacement possible selon l’axe z d’un point de l’objet avant que l’image ne change (voir annexe). Pour un objectif x100, NA=1,25 et n=1,515, pour l = 530 nm, D = 0,4 µm.
Certains auteurs considèrent qu’il n’est pas utile d’échantillonner selon l’axe z avec un pas inférieur à la profondeur de champ. Mais d’autres affirment cependant qu’une infinité de plans selon z est nécessaire pour arriver à une reconstruction correcte de l’objet.

Avec les caractéristiques de l’objectif ci-dessus, à 530 nm, le pas d’échantillonnage théorique est de dz = 0,248 µm et dx= dy = 0,09 µm. En pratique, dz = 0,125 µm (ou 0,25 µm) et dx= dy = 0,06 µm pour l’utilisation de la caméra en binning 1. Ces valeurs respectent, pour cet objectif, les conditions énoncées dans le théorème de Shannon appliqué au microscope. En binning 2, dz = 0,25 µm et dx= dy = 0,12 µm, ce qui reste satisfaisant.

Le cytosquelette cellulaire

A l’intérieur de la cellule, les tensions mécaniques se répartissent dans le réseau de microfilaments élastiques du cytosquelette.

Ces microfilaments tirent la membrane de la cellule et tous ses constituants internes vers le noyau central.

Deux types principaux d’éléments travaillant en compression s ’opposent à ces tractions vers l’intérieur, l’un est situé à l’extérieur de la cellule et l’autre à l’intérieur.

Le composant externe est la MATRICE EXTRACELLULAIRE; les tiges internes comprimées sont soit des microtubules, soit de grands faisceaux de microfilaments entrecroisés à l ’intérieur du cytosquelette.

Les filaments intermédiaires, le troisième composant du cytosquelette, constituent les organes de liaison de l’ensemble, reliant les microtubules et les microfilaments contractiles entre eux, à la membrane cellulaire et au noyau. En outre, ils constituent des sortes de « hauban » qui maintiennent en place et immobilisent le noyau, au centre.

Microfilaments de F-actine d ’une cellule endothéliale

(D.Dumas)