Microscopie FRAP Diffusion

Principes

L’analyse des jonctions communicantes (connexines) et de leur fonctionnalité peut être réalisée par différentes techniques telles que l’analyse cytométrique, l’imagerie microscopique ou le transfert de colorant (dye transfer) et enfin le FRAP (fluorescence recovery after photobleaching).
La technique de FRAP mesure la cinétique de redistribution de fluorescence intra ou inter cellulaire, après qu’elle ait été photoblanchie. La mesure est rapide et faiblement invasive.

Retour de fluorescence

Fibroblaste marqué au 5-6CFDA. 
J.R. Stines – D.Dumas

La technique de gap-FRAP mise en oeuvre au Laboratoire utilise une sonde spécifique dérivée de la fluoresceine, le 5.6CFDA (5.6 carboxyfluorescein diacetate). 
Après avoir subi une hydrolyse par des enzymes estérases aspécifiques, le 5.6CFDA devient fluorescent et hydrophile (carboxyfluoresceine) . 
La sonde marque alors le cytoplasme des cellules. Sa masse molaire de 460.4 Da et son caractère hydrophile lui permet de  diffuser préférentiellement à travers les jonctions communicantes. La cinétique de FRAP permet ainsi de mettre en évidence le nombre et la fonctionnalité des jonctions communicantes.

FRAP Principe, recouvrement de fluorescence après photoblanchiment

 

Autres travaux

STINES JR, DIDELON J, BLONDEL W, DUMAS D, GUILLEMIN F. Discrimination  normal-cancerous cells by gap-FRAP: feasibility in endoscopy. Photonics Europe, 26-30 avril 2004, Strasbourg. présentation . 

ABBACI M, STINES JR, DIDELON J, BLONDEL W, DUMAS D, GUILLEMIN F. Etude des connexines et analyse de l’activité des jonctions communicantes par la technique de FRAP de cellules saines et cancéreuses.Diagnostic et Imagerie Optique en Médecine/Biologie. Cinquième colloque national. 11-13 mai 2004. Val de Grâce Paris .Opt-Diag 2004. poster.

ABBACI M, STINES JR, BARBERI-HEYOB M, BLONDEL W, DUMAS D, GUILLEMIN F AND DIDELON J
In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique.
12-16 June 2005, Munich, Proceedings of SPIE 

STINES JR, ABBACI M, BLONDEL W, BARBERI-HEYOB MDUMAS D, GUILLEMIN F AND DIDELON J
Optimisation instrumentale de la technique de gap-FRAP visant à discriminer différents types cellulaires selon l’activité des jonctions communicantes
21-23 Mars  2005, Nancy, Congrés JSTI

ABBACI M, BARBERI-HEYOB MSTINES JR, BLONDEL W, DUMAS D, GUILLEMIN F AND DIDELON J
Gap junctional intercellular communication capacity by gap-FRAP technique: A comparative study.
Biotechnol J. 2007.Accepté.